A) Sottolineiamo che i partecipanti all'appalto hanno fissato gli obiettivi abbondantemente due anni fa, lavorano insieme su questi piani su base giornaliera e possono produrre una serie di risultati preliminari incoraggianti. A causa della scarsità di risorse, questi risultati non sono sistematici: abbiamo lavorato con poche molecole attive, pochi agenti patogeni, e mancano test in vivo. Una domanda di successo colmerebbe questa lacuna. Il nostro piano di lavoro prevede due sottoprogrammi, che presentiamo, che illustrano i risultati preliminari, i piani e i risultati sperati. Sottoprogramma 1 1.1 Prova dei ceppi resistenti agli antibiotici contro gli AMP (Pál), il sequenziamento completo del genoma (Kondorosi) e l'analisi bioinformatica dei risultati (Papp) 1.2 AMP — combinazioni antibiotiche a bassa molecola (Pál, Papp) 1.3 Sintesi di nuovi elementi costitutivi per piegatori mimetici AMP (Fülöp), commutazione e purificazione delle sequenze (Martinek, Tóth), e la caratterizzazione biofisica (Martinek) 1.4 Prova dei pieghevoli mimetici AMP in vitro e in vivo (Pál, Kondorosi) e dei test di tossicità (Földesi) 2 sottoprogramma 2.1 Produzione di analoghi pieghevoli SSB-C (Martins), stabilizzazione tramite ponte a catena laterale (Tóth), sintesi dei monomeri richiesti (Fülöp) e test in vitro per l'inibizione della PPI. 2.2 Mmetici SSB-C — Caratterizzazione strutturale dell'interazione Reco-WH (Martinek) 2.3 SSB-C Analogs Optimizing Dynamic Covalent Library Method. Studi di penetrazione cellulare (Martin) 2.4 Studi evolutivi in vitro in tempo reale, test antibatterici (Pál, Papp), studi di tossicità (Göldesi). B) 1. SOTTOPROGETTO: I Peptidi antimicrobici AMP sono peptidi corti con una struttura e una funzione divergenti che proteggono l'ospite da varie infezioni microbiche. Si trovano in piante, animali, funghi e fanno parte di un sistema primario di protezione contro gli agenti patogeni. [Natura 2002, 415, 389] Anche se sono rimasti efficaci in evoluzione, la loro applicazione pratica solleva una serie di problemi, due dei quali si concentrano su: 1) Al momento, c'è un serio dibattito sullo sviluppo della resilienza contro queste molecole e, in caso affermativo, quali effetti collaterali dannosi può avere. [FEMS Microbiol Lett 2012, 330, 81] 2) Un ulteriore problema prima dell'uso clinico dei peptidi è che a volte sono difficili da somministrare e assorbire e possono essere degradati dagli enzimi umani che riducono le proteine (proteasi). La loro stabilità in vivo è spesso insoddisfacente. Le nostre indagini preliminari dimostrano che questi problemi possono essere superati. Inoltre, gli AMP sono particolarmente efficaci contro i batteri multiresistenti. Per fare questo, è necessario selezionare AMP contro i quali non si osservano resistenze. Queste molecole sono la base per un ulteriore sviluppo: pur mantenendo le proprietà strutturali e funzionali di cui sopra, progettiamo le cosiddette molecole pieghevoli peptidomimetiche. Il nostro obiettivo è dimostrare che la combinazione di questi peptidomimetici con antibiotici è eccezionalmente efficace nella lotta contro la resistenza. Risultati preliminari e piani: Il tallone d'Achille di batteri multiresistenti può essere attaccato da AMP. Dettagliati test genetici, biochimici, fenotipus e test di espressione a livello genoma dei gruppi guidati da Csaba Pál, Balázs Papp ed Éva Kondorosi hanno confermato che la struttura della membrana, la rigidità e la composizione proteica della membrana dei batteri resistenti spesso cambiavano significativamente. [NAT Commun 2014, 5, 4352; Mol Syst Biol 2013, 9, 700] Dal momento che la maggior parte dell'obiettivo primario di AMP è la membrana batterica, è stato suggerito che la resistenza agli antibiotici influisce anche sulla suscettibilità all'AMP. Il risultato è stato inaspettato e molto interessante. Il 90 % dei ceppi multiresistenti è diventato ipersensibilità a più AMP: rispetto ai ceppi di controllo basali, la sensibilità di questi ceppi è generalmente aumentata di due o tre volte. Ciò dimostra che vi è un grave costo dello sviluppo della resistenza agli antibiotici, che può essere potenzialmente sfruttato dalla co-somministrazione di antibiotici e AMP. Efficace terapia di associazione antibiotica AMP. Nella fase successiva, i partner si concentrano su due questioni chiave. Esistono AMP che sono co-somministrati con antibiotici (a) inibiscono la resistenza de novo in vitro e (b) uccidono efficacemente batteri multiresistenti. I loro studi si concentrano su due PAA: il peptide NCR335 e la famiglia di peptidi selfinine a PGLA. Per entrambi i peptidi, il 90-100 % dei ceppi resistenti ai farmaci è rimasto altamente sensibile. Risultati preliminari: a) I batteri resistenti alla tetraciclina e alla ciprofloxacina sono diventati più sensibili a questi agenti aggiungendo PGLA all'antibiotico. L'impatto è drammatico in diversi casi: la suscettibilità antibiotica aumenta 10-50 volte con una dose di PGLA molto bassa (subinibitoria).